１）GFPクロモホアをモデルにした低分子蛍光化合物"DAIN"の開発

GFPは、海洋生物であるオワンクラゲから単離された緑色蛍光タンパク質であり、下村脩博士は本研究成果により2008年にノーベル化学賞を受賞されています。本タンパク質の蛍光を発するクロモホア構造は図に示すような構造を持っています。本構造は、タンパク質構造中にある場合にはZ型に固定されていますが、その部分構造のみを化学合成し、タンパク質構造と切り離した場合、光照射によって容易にE型に異性化し、そのZ型は高い蛍光能を有するのに対し、E型の蛍光能は一般的に低いことが知られています（図2）。

図2　GFPクロモホアの光異性化とDAINの構造

我々は、GFPクロモホア構造を基に、光照射により異性化しても蛍光能が低下しない蛍光分子としてDiarylmethyleneimidazolinone（DAIN）1を設計、合成し（図2）、その蛍光分子としての有効性を報告しました。本化合物の特徴は、光異性化しても構造変化しない（蛍光能が低下しない）点に加えて、ジアリールメチレン構造が回転可能な溶液状態では、蛍光を示さないのに対して、回転不可能な状態、すなわち凍結状態や固体状態では蛍光を示す点にあります。図3に示すように蛍光色や蛍光強度に関しては、分子の構造や分子の会合状態（集まり方）に依存することも明らかになりました。
現在、DAIN構造に様々な複素環構造を結合させるなどの修飾を行い、固体、溶液状態およびその凍結状態での蛍光特性を評価し、新たな蛍光特性をもつ蛍光分子の開発を行っています。

図3　DAIN 1a-cの結晶、溶液および凍結溶液状態の蛍光

２）DAINの特性を活かした各種センサー分子の開発

DAINのジアリールメチレン構造が回転できる時には無蛍光（Switch OFF）、回転が阻害された時には蛍光を示す（Switch ON）という性質に着目し、DAIN構造を適切な生体分子で修飾することによって様々なセンサー分子の開発につながると考え、以下のような研究を展開しています。

2-1）膜構造の流動性に応答する蛍光分子プローブの開発

ヒトの細胞は脂質二重膜構造を持つ細胞膜で外界から遮られており、薬物がその効果を表すためには細胞膜を通過する必要がありますが、膜機能の詳細は明らかではありません。我々は、DAINを脂質二重膜に取り込ませることによって、脂質二重膜の流動性（粘性）に応じて蛍光強度が変化する"流動性応答型蛍光分子プローブ"の開発につながるものと考え、またそのような蛍光プローブは膜機能解明の一助となると考え本研究に着手しました。すなわちDAIN構造と膜成分の一種であるコレステロールの母核（コレステン骨格）とのハイブリッド構造を持つDAIN 1d, 1eを合成し、人工脂質二重膜中での蛍光強度を測定したところ、膜の流動性に依存して蛍光強度が変化し、流動性応答型蛍光分子プローブとして働くことを明らかにしました（図4）。現在、細胞膜でも適応可能な流動性応答型蛍光分子プローブを開発すべく、さらなる改良を行っています。

図4　DAIN 1d, 1eの構造と予想される脂質中での配向

2-2）二重鎖DNAの配列を認識する蛍光分子プローブの開発

現在、DNAはPCR（Polymerase Chain Reaction）の手法を用いて増幅させることにより、非常に高感度かつ高精度で分析が可能となっていますが、装置と時間が必要であり、患者のベッドサイドで簡単にできるというものではありません。我々は、DAINが芳香環のつらなった平面性の高い構造を有していることから、二重鎖DNAに取り込まれることによりDAINの構造が固定され蛍光強度が上昇するものと予測し、DNAのリン酸基との親和性も期待できるDAIN 1f を考案しました。DAIN 1fは、二重鎖DNA存在下で特異的に蛍光を発し、時間経過とともにその強度が上昇することを見出しています（図5）。現在は、二重鎖DNAの配列を認識する分子とDAINを組み合わせることにより、PCRによる増幅作業なしで、特定の配列の二重鎖DNAを検出可能な"塩基配列認識型蛍光分子プローブ"の開発を目指して研究を行っています。

図5　DAIN 1fの構造と二重鎖DNA存在下での蛍光
EtzBr（臭化エチジウム）は既存の二重鎖DNA検出試薬

３）新規複素環合成反応の開発研究

複素環構造は、医薬品をはじめとする様々な機能性分子に必ずと言っていいほど含まれる構造であり、上記各種DAIN 1の合成に際しても、我々は独自の方法でその合成を達成してきました。DAIN以外にも含フッ素置換インドール類2の合成を我々独自の方法で達成しています（図6）。有機化学的な興味から、今後も我々の必要とする複素環構造の合成を、独自の方法で達成すべく挑戦していきます。

図6　DAIN 1および含フッ素置換インドール類2の合成

2021年度

• Acetate/Acetic Acid-Assisted One-Pot Synthesis of (Diarylmethylene)imidazolone from Amide or Thioamide Ikejiri, M.; Watanabe, A.; Katsuda, M.; Funakoshi, M.; Fujisaka, A.; Miyashita, K. Heterocycles, 2021, 102, 516-526.

• Synthesis of Trifluoromethyl Derivatives of Quinoline and Isoquinoline Fujisaka, A.; Aomatsu, D.; Kakutani, Y.; Terai, R.; Sakaguchi, K.; Ikejiri, M.; Miyashita, K. Heterocycles, 2022, 104, 573-584.

2019年度

• Synthesis and environment-dependent fluorescence behavior of a biaryl-conjugated (diphenylmethylene)imidazolinone
  Ikejiri, M.; Nishiguchi, R.; Kubota, C.; Fujisaka, A.; Miyashita, K.
  Org. Biomol. Chem., 2019, 17, 8443–8449.

2018年度

• Synthesis and properties of geometrical 4-diarylmethylene analogs of the green fluorescent protein chromophore
  Ikejiri, M.; Kojima, H.; Fugono, Y.; Fujisaka, A.; Chihara, Y.; Miyashita, K.
  Org. Biomol. Chem., 2018, 16, 2397–2401.

2017年度

• A hybrid molecule of a GFP chromophore analogue and cholestene as a viscosity-dependent and cholesterol-responsive fluorescent sensor
  Ikejiri, M.; Mori, K.; Miyagi, R.; Konishi, R.; Chihara, Y.; Miyashita, K.
  Org. Biomol. Chem., 2017, 15, 6948-6958.

• 緑色蛍光タンパク質(GFP)クロモホアをモデルとした新規蛍光分子の開発
  池尻昌宏，宮下和之
  生産と技術 2017, 69, 50-55.

2016年度

• Synthesis and properties of 4-(diarylmethylene)imidazolinone-conjugated fluorescent nucleic acids
  Okuda, T.; Mori, S.; Kasahara, Y.; Morihiro, K.; Ikejiri, M.; Miyashita, K.; Obika, S.
  Tetrahedron Lett. 2016, 57, 3129-3132.

2015年度

• Synthesis and fluorescence properties of 4-diarylmethylene analogues of the green fluorescent protein chromophore
  Ikejiri, M.; Matsumoto, K.; Hasegawa, H.; Yamaguchi, D.; Tsuchino, M.; Chihara, Y.; Yamaguchi, T.; Mori, K.; Imanishi, T.; Obika, S.; Miyashita, K.
  Tetrahedron 2015, 71, 4987-4998.

2014年度以前

• Design and concise cynthesis of a novel type of green fluorescent protein chromophore analogue
  Ikejiri, M.; Tsuchino, M.; Chihara, Y.; Yamaguchi, T.; Imanishi, T.; Obika, S.; Miyashita, K.
  Org. Lett. 2012, 14, 4406–4409.